Durante la duplicazione del DNA, il doppio filamento è separato attraverso un enzima (elicasi) specifico della replicazione del DNA. Esso agisce rompendo i legami idrogeno instaurati tra le basi complementari.Inoltre questo enzima agisce in coppia con la DNA-girasi che separa i due filamenti di DNA.
Ogni filamento di DNA serve come stampo per la sintesi di un nuovo filamento, prodotto grazie alla DNA polimerasi, cioè: un enzima che controlla la capacità de nucleotide che deve essere polimerizzato di formare le coppie aventi un ingombro sterico identico come lo sono quelle A:T o G:C piuttosto che verificare la correttezza del nucleotide che entra nel sito attivo. Soltanto quando si forma una corretta coppia di basi il 3'-OH dell'innesco ed il fosfato in α del nucleotide che deve essere polimerizzato si trovano in una posizione ottimale per la formazione del legame fosfodiesterico.
Il processo di duplicazione del DNA è detto Replicazione. Durante la replicazione del DNA la direzione di sintesi è da 5' a 3'. Poichè il DNa ha due filamenti antiparalleli, un filamento (detto leading) viene sintetizzato continuamente, l'altro (detto lagging) ni modo discontinuo, con la formazioni dei frammenti di Okazaki (corte catene di RNA che servono per far procedere al contrario la DNA polimerasi per piccoli tratti).
Osserviamo un'animazione:
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